打开文本图片集
摘 要 探究水杨酸（Salicylicacid，SA）和茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）不同浓度处理下‘鬼椒王’果实胎座中辣椒素和二氢辣椒素含量的变化。采用高效液相色谱法（HPLC），对不同浓度SA和MeJA喷施后的‘鬼椒王’5个生长期的果实胎座辣椒素和二氢辣椒素含量进行测定。结果表明：（1）不同浓度SA和MeJA处理条件下，处理与对照中辣椒素和二氢辣椒素含量呈现出相同的变化趋势，先增加，并在40 d左右（即果实转红期）达到最高，40～50 d含量降低。（2）SA处理中，较低浓度（1.5 mmol/L）的喷施最有利于辣椒素和二氢辣椒素的积累，最大含量分别为98.400 mg/g和5.771 mg/g，而高浓度（2.5、3.5、5.0 mmol/L）的处理显著抑制了辣椒素的积累。（3）MeJA处理下，4个浓度水平的MeJA（1.0、1.5、2.5、3.5 mmol/L）处理均促进辣椒素和二氢辣椒素的积累，其中，在2.5 mmol/L MeJA的处理下，辣椒素和二氢辣椒素达到最大值，分别为116.181 mg/g和7.035 mg/g。本研究为外施SA和 MeJA促进辣椒中辣椒素的含量提供了科学依据。
关键词 鬼椒王;辣椒素;二氢辣椒素;含量;茉莉酸甲酯;水杨酸
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
Effects of Salicylicacid and Methyl Jasmonate on
Capsaicinoids Content of Guijiaowang（Capsicum frutescens）
ZHANG Zixin， HUANG Zumei， CHENG Shanhan*， ZHAO Shuniu
Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry
of Education / College of Horticulture and Gardening， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract ‘Guijiaowang’（Capsicum frutescens）was used to study the effect of the Salicylicacid（SA）and Methyl Jasmonate（MeJA）with different concentrations on capsaicin and dihydrocapsaicin content. Capsaicin and dihydrocapsaicin contents were analysed by HPLC after SA and MeJA treatments at different concentrations. The results were as followed：（1）The treatment effects under different concentrations of SA and MeJA showed a consistent change tendency of capsaisin and dihydrocapsaisin in plasenta with the control. The contents of capsaisin and dihydrocapsaisin increased firstly and reached peak at 40 days after anthesis，then decreased from 40 to 50 days after anthesis.（2）Under SA treatment， low concentrations（1.5 mmol/L SA）were the most conducive to the accumulation of capsaicin and dihydrocapsaicin， peak value up to 98.400 mg/g and 5.771 mg/g respectively. Relatively high SA levels（2.5， 3.5， 5.0 mmol/L SA）significantly inhabited the accumulation of capsaisin and dihydrocapsaisin.（3）Under MeJA treatment， four out of five MeJA concentration levels were beneficial to enhance capsaicin and dihydrocapsaicin content to different levels. The maximum vaules reached to 116.181 mg/g and 7.035 mg/g of capsaisin and dihydrocapsaisin respectively at 2.5 mmol/L MeJA treatment. This study would provide a reference for the exogenous application of SA and MeJA to enchance the contents of capsaicinoids.
Key words Guijiaowang（Capsicum frutescens L. var. grossum L. H. Bailey）; Capsaicin; Dihydrocapsaicin; Cotent; Methyl Jasmonate; Salicylicacid
辣椒素类物质（capsaicinoids）是辣椒果实辣味的主要成分，包括辣椒素（capsaicin）、二氢辣椒素（dihydrocapsaicin）等十余种类型，其中辣椒素和二氢辣椒素占总辣度的80%以上，是辣味最主要的决定因素，最早由Thresh[1]从辣椒果实中分离出来，是一种香草酰胺衍生物，化学结构为C18H27NO3[2]。Iwai等[3]认为辣椒素类物质主要产生于果实胎座表皮细胞的液泡中，且随着果实的成熟，通过子房隔膜逐渐运送至果肉表皮细胞的液泡中积累，因而在辣椒果实中胎座的辣椒素类物质含量最高，果肉次之，种子最低。狄云等也通过试验说明了胎座是果实中辣椒素合成和积累的主要部位[4]。
辣椒素类物质的含量是评估辣椒果实品质性状的最重要指标，在食品、医药、保健、农药、工业等领域都具有重要应用[5]。辣椒素类物质的生物合成主要受遗传和环境两方面的影响，天然辣椒素类物质合成非常有限，远不能满足市场需求[6]。因而如何快速有效提高辣椒素类物质含量及培育高含量辣椒素的辣椒成为一个重要的课题。到目前为止，由于辣椒素的生物合成路径极为复杂，对于辣椒素合成途径的研究尚有许多未解决的问题[7]。基于此，本研究以印度魔鬼椒中辣味极重的‘鬼椒王’（Capsicum frutescens L. var. grossum L. H. Bailey）为材料，通过对不同浓度MeJA和SA处理前后辣椒果实胎座各发育阶段辣椒素和二氢辣椒素含量的测定，研究辣椒素和二氢辣椒素含量变化规律。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料和处理方法 ‘鬼椒王’（Capsicum frutescens L. var. grossum L. H. Bailey），印度魔鬼椒的一个栽培种。2013年10月种植于海南大学园艺试验基地，按照露地栽培方式进行田间管理。SA和MeJA分别配成1、1.5、2.5、3.5、5.0 mmol/L的溶液，以纯水喷施作对照，在初花期和盛花期喷洒整株植株，重复处理5次，每重复间隔5 d。取花后10～50 d辣椒胎座，50 ℃干燥6 h，粉碎过筛后置于干燥器中保存备用。
1.1.2 试剂 水杨酸（SA）;茉莉酸甲酯（MeJA），C13H20O3，Methyl Jasmonate，95%;辣椒素标样，Capsaicin，C18H27NO3，≥99.0%（HPLC）;二氢辣椒素标样，Dihydrocapsaicin，C18H29NO3，≥97.0% （HPLC）。以上试剂均购至Sigma公司。甲醇（色谱纯，Tedin公司）。其他试剂为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 辣椒素类物质的提取 取新鲜‘鬼椒王’果实胎座，于50 ℃干燥6 h，粉碎后过80目筛，置于干燥器中保存备用。称取辣椒粉0.2 g，置于碘量瓶中，加入精密量取的70%乙醇溶液2.0 mL，盖上盖子并用封口膜封口后，超声处理50 min。用0.45 μm滤膜过滤后分装至1.5 mL离心管备用。
1.2.2 辣椒素、二氢辣椒素的测定 采用高效液相色谱系统（HTTACHI L 2 000）进行测定。色谱条件为：色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），体积比70 ∶ 30甲醇-水流动相，流速1.0 mL/min，UV检测波长280 nm，柱温为室温，进样量10 μL。
1.2.3 辣椒素、二氢辣椒素的分析 制作标准曲线：制备0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L浓度的辣椒素和二氢辣椒素对照品溶液，分别精密吸取10 μL注入色谱仪，重复进样两次，测定峰面积积分值。以质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线回归方程为：辣椒素：y=3 876 205.61x-3 018.66（R=0.99）;二氢辣椒素y1=26 699 513.76x1-47 887.01（R12=0.99）。
2 结果与分析
2.1 辣椒素和二氢辣椒素出峰结果
如图1所示，HPLC检测辣椒素、二氢辣椒素标样的色谱图出峰时间分别为9.5 min和12.5 min左右，待测样品的出峰时间与之一致，故本试验采取的保留时间16 min。
相同处理条件下，以40 d的峰面积值最大。SA处理的辣椒植株，浓度1.5 mmol/L的处理峰面积值最大，1.0 mmol/L次之，比2.5 mmol/L略大，但均比对照大，5.0 mmol/L的处理最小，与3.5 mmol/L的接近。MeJA处理的辣椒植株，浓度2.5 mmol/L的处理峰面积值最大，10、20、30 d 1.5 mmol/L处理的峰面积值较大，40、50 d 1.0 mmol/L处理的峰面积值较大，均比对照大。5.0 mmol/L的处理峰面积值最小。
2.2 不同处理后辣椒素类物质含量的动态变化
不同处理后的辣椒素类物质积累的过程基本一致，在10～20 d缓慢积累，30～40 d（青果至转红期）合成急剧增加，在40 d左右（即果实转红期），达到最高，之后又都有减少（图2）。
如图3所示，1.5 mmol/L SA和2.5 mmol/L MeJA处理的辣椒植株，其果实胎座辣椒素和二氢辣椒素的含量几乎在各个时期时较其它处理都高，且花后40 d时辣椒素含量达到最大值，分别为98.400 mg/g和116.181 mg/g，显著高于对照的71.375 mg/g。1.0 mmol/L SA处理下，40 d的胎座辣椒素含量与对照相比差别不显著，二氢辣椒素的含量有显著的提高。2.5 mmol/L SA处理下，花后40 d的胎座辣椒素和二氢辣椒素含量相比对照来说，有显著的减少。更高浓度的SA（3.5 mmol/L和5.0 mmol/L）处理减少更为显著。1.0 mmol/L MeJA、1.5 mmol/L MeJA和3.5 mmol/L MeJA处理条件下的果实胎座辣椒素和二氢辣椒素含量在花后40 d时均比对照高。1.0 mmol/L MeJA和3.5 mmol/L MeJA处理条件下的辣椒植株其胎座辣椒素和二氢辣椒素含量在花后40 d时基本相同，1.0 mmol/L MeJA处理相比之下略高。1.5 mmol/L MeJA处理测得的各个时期辣椒素和二氢辣椒素含量都较高。5.0 mmol/L MeJA处理与其他浓度MeJA处理相比，辣椒素和二氢辣椒素含量都明显降低，尤其在35～50 d最为明显。
‘鬼椒王’果实胎座辣椒素和二氢辣椒素的含量在40 d后均有下降，就40～50 d的下降趋势看，1.0 mmol/L和1.5 mmol/L SA下降幅度均比对照和同浓度的MeJA小，2.5 mmol/L、3.5 mmol/L及5.0 mmol/L的SA处理下降幅度均比对照大。而所有不同浓度MeJA处理的辣椒植株，其下降幅度均比对照大。对照组辣椒素比二氢辣椒素在40 d后的下降幅度大，二氢辣椒素较稳定。
3 讨论与结论
宏观上，辣椒果实中的辣椒素类物质含量因辣椒品种、果实发育时期、部位不同而差异较大，辣椒素类物质积累高峰期出现的早晚因品种而异，与其遗传特性有关[4]。微观上，辣椒果实的辣椒素类物质含量受合成与降解两方面的共同影响[10]。对‘鬼椒王’这一极辣辣椒品种而言，辣椒素和二氢辣椒素积累高峰期均出现在40 d左右，即果实转红期。转红期至成熟期略有降低是受到辣椒素类物质合成减少和降解增多的共同影响，不能单一而论。
茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）都是广泛存在于植物体内的一类化合物，在植物细胞中起信号转导作用，对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用[11]。研究者发现SA可提高悬浮细胞中辣椒素的含量，转录因子WRKY能对水杨酸及其功能类似物产生应答[10]。胡文忠等研究发现，适宜浓度茉莉酸甲酯处理有利于提高PAL活性，但当茉莉酸甲酯浓度过高时，会抑制PAL的活性[12]。邓明华等研究发现茉莉酸类物质能诱导苯丙氨酸转氨酶（PAL）等与抗逆相关的基因表达[13]。AN Yu等在研究茉莉酸甲酯（MeJa）和水杨酸甲酯（MeSa）诱导植物叶片内酚酸含量的差异时，发现熏蒸后的黑杨叶片内香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和苯甲酸含量均增加[14]。推测认为，MeJA和SA同样能诱导辣椒素合成中间物质对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸含量的增加。
Sudha和Ravishankar在分别单独和共同培养小米椒细胞悬浮液的试验中发现，SA和MJ这2个信号化合物均能提升辣椒素的积累。MeJA能抑制植物生长，减少植物生物量的生成[15-16]。外源喷施适当浓度的MeJA和SA能够显著增加辣椒素类物质的积累，以1.5 mmol/L SA和2.5 mmol/L MeJA效果最为显著。具体来说，茉莉酸甲酯对辣椒果实辣椒素含量增加有显著效果，但在种植过程中也发现，喷施了高浓度茉莉酸甲酯的植株后期衰老加快，植株长势较弱。这也许解释了MeJA处理的‘鬼椒王’植株其果实胎座辣椒素含量在40～50 d的下降幅度大的原因。对以生长量为生产目标的植株，茉莉酸甲酯对其生长的抑制及生育期的缩短，在一定程度上限制了其在植物中的应用。但生育期的缩短，可以减少生产成本，这在一定程度上抵消了茉莉酸甲酯抑制作用带来的负面影响[17]。低浓度（1.0、1.5 mmol/L）的SA处理的植株其生育期延长，辣椒素类物质后期下降缓慢，果实胎座辣椒素类物质含量在50 d时仍能保持较高的水平，因而延长了采收期。单看低浓度SA处理的二氢辣椒素在转红期至红果期含量下降幅度不大，比较稳定，与对照组一致，而10～40 d时的上升幅度比对照组大。这在以往的研究中对二氢辣椒素的合成涉猎很少。高浓度（2.5、3.5、5.0 mmol/L）的SA处理辣椒素含量后期下降幅度显著增大，这也许是由于高浓度SA处理对辣椒素植株生长有损害，抑制生长导致的。对于以辣椒素类物质为生产目标的辣椒品种来说，选取低浓度MeJA处理并在辣椒素积累最多时（40 d）采收是可行的。但考虑到节约成本和采收时间的宽裕性，由于MeJA的价格较高，不适宜大面积应用，且后期辣椒素类物质下降较快，虽然处理效果比SA处理好，但相差不大，因此在实际生产中，建议采用低浓度SA处理以获得高浓度辣椒素类物质。当然，使用时也要根据各自实际需要条件，权衡两者利弊，合理选择。
参考文献
[1] Thresh J C. Capsaicin，the active principle of Capsicum fruits[J]. Pharm J， 1876， 1（8）： 148b-149.
[2] 李光光， 陈国菊， 曹必好， 等. 不同辣椒基因型辣椒素的积累特性[J]. 中国蔬菜， 2010， （24）： 31-35.
[3] Iwai Kazuo， Tetsuya Suzuki， HideshiFujiwake， et al. Formation and accumulation of enzymes involved in capsaicin biosynthesis in cell tissue and fruits of chili pepper[J]. Agric Biol Chem， 1979， 43： 2 493-2 498.
[4] 狄 云， 蒋健箴， 石正强， 等. 辣椒果实成熟过程中辣椒素的降减[J]. 食品科学， 2000， 21（60）： 19-22.
[5] 成善汉， 吴艳阁， 贺申魁. 辣椒素生物合成路径及调控基因研究的最新进展[J]. 分子植物育种， 2008， 6（2）： 335-340.
[6] 阮文渊. 辣椒素生物合成途径基因的表达分析及遗传转化研究[J]. 东北农业大学学报， 2011， 42（1）： 103-108.
[7] 吴奕敏， 李光光， 杨 崇， 等. 小米椒辣椒素类物质含量测定[J]. 华南农业大学学报， 2014， 35（5）： 52-56.
[8] Sudha G， Ravishankar G A. Influence of calcium channel modulators in capsaicin production by cell suspension cultures of Capsicum frutescens Mill.[J]. Current Science， 2002， 83（4）： 480-484.
[9] Sudha G， Ravishankar G A. Influence of methyl jasmonate and salicylic acid in the enhancement of capsaicin production in cell suspension cultures of Capsicum frutescens Mill.[J] Current Science， 2003， 85（8）： 1 212-1 217.
[10] 李彦磊. 辣椒果实辣椒素积累和生物合成相关基因表达分析[D]. 长春： 吉林大学， 2013.
[11] Wasternack C. Jasmonates： an update on biosynthesis， signal transduction and action in plant stress response， growth and development[J]. Ann Bot， 2007， 100 （4）： 681-697.
[12] 胡文忠， 姜爱丽， 杨 宏， 等. 茉莉酸甲酯对鲜切苹果生理生化变化的影响[J]. 食品工业科技， 2012， （16）： 338-346.
[13] 邓明华， 文锦芬， 朱海山， 等. 辣椒素生物合成相关基因研究进展[J]. 辣椒杂志， 2012（3）： 1-5.
[14] Yu A N， Shen Y B， Wu L J. A change of phenolic acids content in poplar leaves induced by methyl salicylate and methyl jasmonate[J]. Journal of Forestry Research， 2006， 17（2）： 107-110.
[15] Ueda J， Kato J. Isolation and identification of asenescence promoting substance from worm word Artemisia absinthium L[J].Plant Physiol， 1980， 66： 246-249.
[16] Mangas S， Bonfill M， Osuna L， et al. The effect of methyl jasmonate on triterpene and sterol metabolisms of Centellaasiatic， Ruscusaculeatus and Galphimiaglauca cultured plants[J]. Phytochemistry， 2006， 67： 2 041-2 049.
[17] Kim O T， Kim M Y， Hong M H， et al. Stimulation of asiaticoside production from Centellaasiatica whole plant cultures by elicitors[J]. Plant Cell Rep， 2004， 23： 339-344.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.011