摘要：本研究以烟草为材料，利用农杆菌介导法导入花青素合成转录因子Vlmyb2，对抗性植株进行鉴定得到转基因植株。实验结果表明：转Vlmyb2基因烟草植株的花青素含量高于4mg/g的转基因植株，叶绿素含量反而低，花青素与叶绿素呈现出较为明显的线性反比关系。当花青素含量较低，叶绿素含量反而升高。测定烟草光合速率实验结果表明：转Vlmyb2基因调节花青素结构基因在烟草中超表达会降低植株的光合效率，但降幅并不显著，对植株正常生长没影响。扫描电镜实验结果表明：Vlmyb2转录因子表达量高的株系腺毛密度比对照高了约23%，相反，Vlmyb2转录因子表达量低的株系的比对照低了约15%，Vlmyb2转录因子的表达影响了烟草腺毛的发育。
关键词：烟草；Vlmyb2基因；叶绿素；光合速率
中图分类号：Q812文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）01-0007-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.01.002
Study on Genetic Transformation of Tobacco with Anthocyanin Synthetic Transcription Factor Vlmyb2
SUN Jingwen， LV Litang*，ZHAO Degang*
（1Institute of Agro-Bioengineering， College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China； 2The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region， Ministry of Education， Guizhou University， Guiyang 550025，China ）
Abstract：In this study， tobacco was used as the material to introduce the anthocyanin biosynthesis transcription factor V1myb2 by Agrobacterium-mediated transformation， and the transgenic plants were identified through the identification of resistant plants. The results showed that the anthocyanin content in V1myb2 transgenic plants was higher than that of 4mg/g transgenic plants， the content of chlorophyll was rather low. Anthocyanin and chlorophyll showed obvious linear inverse relationship； when anthocyanin content is low， chlorophyll content increases instead. Results from the determination of tobacco photosynthesis rate showed that： over-expression of transgenic Vlmyb2 gene regulation of anthocyanin structural genes in tobacco would reduce photosynthetic efficiency， but the decline was not significant and did not affect the normal growth of the plant. The results of scanning electron microscopy showed that the density of glandular hairs in he transgenic plants with high V1myb2 transcription factor was about 23% higher than that of the control. In contrast， the low expression of the V1myb2 transcription factor was about 15% lower than that of the control. The V1myb2 transcription factor expression affects the development of tobacco glandular hairs.
Key words：tobacco； Vlmyb2 gene； chlorophyll； photosynthetic rate
花青素（anthocyanin）是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮类化合物，也是植物的主要呈色物质。研究表明，摄入花青素能够降低心血管疾病、糖尿病、关节炎和癌症的发病率[1-3]。花青素还有抗氧化、抗增生和减轻肝机能障碍及抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能[4-5]。目前已从葡萄、拟南芥、矮牵牛、紫甘薯等植物中克隆了大量与花青素生物合成代谢相关的结构基因与调控基因。Vlmyb2转录因子是花青素合成途径中的调節基因，该基因通过调节花色素苷的合成来决定葡萄浆果的颜色[6]。花青素的生物活性研究已经有很多成果，也有研究者尝试在一些花青素含量比较低的植物中转入花青素合成相关基因，增加花青素的表达，其结果是植株抗氧化能力得到了提升[7]。本次研究通过转花青素合成转录因子Vlmyb2并对烟草生理特征进行测定，探究Vlmyb2基因的表达对植株生长的是否有影响。
山地农业生物学报2018年第1期孙婧文，等：花青素合成转录因子V1myb2遗传转化烟草的研究1材料与方法1.1材料
本研究的遗传转化受体材料为烟草。质粒主要包含有目的基因Vlmyb2和筛选基因 NPTⅡ （新霉素磷酸转移酶基因）、GUS （β-葡萄糖苷酸酶基因）报告基因表达元件的植物表达载体，植物表达载体由本实验室构建。农杆菌菌株为EHA105。
1.2农杆菌介导遗传转化
采用叶盘法遗传转化烟草。参照姚新转等[7-8]烟草组织培养方法，直到抗性苗长至4～5cm时，移栽于营养土中生长，期间不定期追肥。
1.3转基因植株检测
经卡那霉素筛选的烟草生长至4～6叶期时，剪取叶片进行GUS组织化学染色，鉴定后，按照天根生化科技（北京）有限公司新型植物总DNA提取试剂盒步骤分别提取GUS染色阳性烟草和野生型烟草DNA，用于PCR鉴定[8]。
1.4花青素相对含量的测定
参照张志良[9]的测定方法。
1.5叶绿素含量的测定
参照张志良[9]的测定方法。
1.6光合速率测定
选取转基因植株与野生型植株共计10株，每株测量从顶端往下第三片成熟叶片。选择晴朗无风的天气，在上午9点～11点，利用美国Li-6400便携式光合仪，选取植株顶端往下第三片全展成熟叶片测定其净光和速率（Pn）、蒸腾速率（trmmol）、胞间CO2和气孔导度（Cond）4个指标，每片叶片测3个重复。
1.7细胞学观察
参照付洪兰[10]的测定方法取生长60 d左右的转基因和野生型烟草烟草成熟叶片做细胞学观察，转基因和野生型各选取3株，每株3个重复，在样品观察时每个重复选取5个视野，用5-3400N扫描电镜对烟草叶片表面腺毛形态、腺毛密度进行观察并拍照。
2结果与分析2.1转基因植株的获得及PCR鉴定
对33株烟草抗性植株的叶片进行GUS组织化学染色，结果显示抗性植株叶片显现蓝色，而非转基因植株叶片并未染出蓝色（图1）。对GUS呈阳性的植株进行Vlmyb2基因的PCR扩增，电泳结果显示，质粒对照和抗性植株均能扩增得到419 bp的特异条带，非转基因植株没有扩增出特异条带（图2），说明外源基因已经整合到烟草基因组中，初步证明获得了转Vlmyb2基因烟草植株。
花青素含量的测定
以野生型烟草植株作为对照，选取转V1myb2基因的烟草植株8个不同株系进行花青素含量的测定。转Vlmyb2基因烟草的花青素的表达量与野生型植株相比有了较大的提高。不同株系的花青素表达量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右。花青素含量中等的植株TP2、TP3 和TP6是对照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的255和677倍。
2.2花青素含量的测定
以野生型烟草植株作为对照，选取转Vlmyb2基因的烟草植株8个不同株系进行花青素含量的测定。转Vlmyb2基因烟草的花青素的表达量与野生型植株相比有了较大的提高。不同株系的花青素表达量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右。花青素含量中等的植株TP2、TP3 和TP6是对照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的2.55和6.77倍。
2.3转Vlmyb2 基因对烟草叶片中叶绿素含量的影响
由图3和图4可知：花青素含量高的TP4，TP5和TP7，3个转基因株系，其叶绿素总含量在0.8775～1.048mg/g之间，是所有株系中叶绿素含量中最低的3株。而叶绿素含量较大的WT和TP8株系中，其花青素相对含量低于0.1，为所有株系中较低的。由此可知，花青素的积累总是伴随着叶绿素含量的降低，这与刘国君[10]在研究小苹果不同季节、不同时期的叶绿素，花青素含量的结果一致。受到花青素影响较大的是叶绿素a，而叶绿素b的含量影响不大，叶绿素a作为反应中心色素的只是很少一部分。
and transgenic Vlmyb2 tobacco lines综上，本次试验中，在花青素相对含量高于0494，叶绿素含量低于1329mg/g的植株中，花青素与叶绿素呈现出较为明显的线性反比关系。而当花青素含量低于0494，叶绿素含量高于1329mg/g时这种关系并不明显。
2.4转Vlmyb2基因对烟草叶片光合作用的影响
转花青素转录因子Vlmyb2后的植株叶绿素含量受到了影响，而叶绿素又是植物光和作用途径中
and transgenic tobacco lines重要的一類物质。为了探究叶片中叶绿素含量降低后是否对植株的光和作用是否有影响，使用美国Li-6400便携式光合仪对植株的净光和速率（Pn）、蒸腾速率（trmmol）、气孔导度（Cond）和胞间CO2四个指标（图5～图8）进行了测定，结果显示：转录因子花青素的超表达对烟草叶片的光合速率有一定的影响。由于不同株系间存在着差别，从总体的趋势来看，转基因烟草叶片的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均低于野生型叶片，而胞间CO2的浓度稍高于对照叶片，所以转基因植株的光合效率低于野生型植株。但是，从测定数据上来看，不同株系间光合效率存在着差异，有的株系与野生型烟草相比变化并不明显或者没有变化，说明Vlmyb2基因调节花青素结构基因在烟草中超表达会降低植株的光合效率，但降幅并不显著，对植株正常生长没影响。
of transgenie tobacco leaves2.5烟草腺毛的细胞学分析
叶面腺毛是叶片表皮细胞特化而来的多细胞结构，采用扫描电镜对转基因的植株与对照的纤毛数量观察。结果如下：反面腺毛多于正面腺毛（表1），这与李鹏飞[11]的研究成果相符合。花青素含量高的植株（图9A），不论正面还是背面，其密度都高于WT约23%，差异达到显著性。而花青素中等含量的植株TP3与对照的水平相当，相差不超过5%（图9B和图10B）。花青素含量低的植株TP1的植株其腺毛密度又低于对照组大约15%。这表明，转录因子Vlmyb2花青素的表达对烟草叶片腺毛的密度产生了的影响，高表达V1myb2基因促进腺毛数量的增加，低表达Vlmyb2基因腺毛数量减少。
Fig10Tobacco leaf back glandular hair electron microscopy3结论与讨论长期以来，光和色素的含量被认为与光和速率有直接的关系，本实验中，出现叶绿素的含量很低的植株光和速率没有低于对照太多，有以下几种可能：首先，受到花青素表达影响的大多是叶绿素a，而叶绿素b含量受到的影响不大，叶绿素a作为反应中心色素的只是很少一部分。根据许晓明等[12] 的研究，可以认为花青素的表达并没有影响到反应中心色素。甚至有可能是促进了电子的传递，因而光和速率并没有受到太大的影响。进行测定的时间是在当日的11点左右，气温已经很高，并且光照很强。因此可能部分植株的光和速率已经开始受到抑制，而根据王美玲等[13] 研究，叶片中的花青素有抵御高温的作用，因此，可以认为花青素表达高的植株的光和速率还没有受到抑制。而花青素表达量低的植株则已经受到了高温的抑制，导致光和速率下降。所以出现了花青素含量高的植株光和速率与对照差别不大的情况。
本试验结果表明，Vlmyb2转录因子对烟草的腺毛数量有所影响，表达量高的植株腺毛数量得到了提升。试验采用的材料在品种上相同，因此排除了腺毛密度不同是由于品种问题。试验材料在农场生长的过程中所有植株的环境一样，所以也排除了环境因素的影响。刘翔等[14]研究表明，myb类转录因子与植株的腺毛生长发育相关，myb类转录因子的过量可以促进腺毛发育起始，产生异位腺毛，从而增加腺毛数量；同时也存在着减少腺毛生长的能力。因此推测，Vlmyb2转录因子同样对腺毛的发育产生了影响，Vlmyb2的高表达促进腺毛发育。利用基因工程创制富含花青素的烟草新品种具有重要意义，但转录因子Vlmyb2 也引起了一些负效应，如降低烟草植株光合效率等，但这些变化并不是很明显。
通过本研究，Vlmyb2基因的表达可以对烟草的花青素合成起调节作用，为创造花青素高含量的烟草奠定了基础。
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收稿日期：2018-01-03；修回日期：2018-01-22
基金项目：国家自然科学基金项目（No31071755/C1408）。